Purificación y caracterización de exosomas para la búsqueda de biomarcadores para uso diagnóstico

Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares (EVs) secretadas por todo tejido o célula viva hacia los fluidos del organismo y pueden ser usados para detectar biomarcadores. En este trabajo se pretende estudiar y seleccionar un método de purificación de exosomas de origen parasitario e intentar detectar algunos biomarcadores con posible uso diagnóstico. Se usará como fluido rico en EVs productos de excreción/secreción del parásito Fasciola hepatica. La metodología para la búsqueda de biomarcadores comienza con la obtención de productos de excreción/secreción (PES) de F. hepatica. Se cultivarán adultos de F. hepatica extraídos de hígados en medio de cultivo RPMI. Los PES de F. hepatica obtenidos se concentrarán para obtener muestras ricas en vesículas extracelulares por ultrafiltración. Luego, se procederá con la purificación de los exosomas. Uno de los objetivos del trabajo de investigación es la evaluación de diferentes métodos de purificación, por lo que se utilizarán 3: ultracentrifugación, precipitación con acetona y precipitación con reactivo comercial. La validación de cada uno de los métodos de purificación se realizará comprobando que se obtuvieron exosomas mediante medición del tamaño en un equipo DLS Brookhaven Zeta Potencial Analyzer. También se mandará realiza microscopía electrónica de transmisión (TEM) para visualizar la forma y tamaño de los exosomas obtenidos. El segundo paso es la  caracterización del perfil de proteínas de los exosomas. Esto se realizará mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Se realizará una corrida con la muestra tratada con detergente para extraer las proteínas de la superficie (caracterización de proteínas de superficie exosomal) y luego de la hidrólisis de las microvesículas (caracterización de proteínas totales). El último paso corresponde a la identificación de biomarcadores ya descritos de PES de F. hepatica, que se se realizará por Western Blot. Para identificar los biomarcadores se usarán anticuerpos primarios específicos que ya dispone el laboratorio, y de anticuerpos conjugados a peroxidasa,  y el revelado se hará por quimioluminiscencia. Se identificarán 3 posibles biomarcadores: catepsina-L, LAP y paramiosina.