Estudio del equilibrio conformacional fully folded-locally unfolded y de la función del Glu143 en el mecanismo de PRDX 5

Las peroxirredoxinas (prxs) son enzimas antioxidantes que realizan la catálisis utilizando únicamente residuos de cisteína. Catalizan la reducción de distintos peróxidos (H2O2, ONOOH y ROOH) de una manera muy eficiente, con constantes de velocidad que van desde 105 a 109 M-1 s-1. La peroxirredoxina 5 (PRDX 5) realiza la catálisis usando dos residuos de cisteína, primero la cisteína peroxidática “Cp” reacciona con el sustrato peróxido dando ácido cisteín sulfénico “Cp-SOH” que posteriormente reacciona con una segunda cisteína, llamada de resolución “Cr” formándose un enlace disulfuro intramolecular. Cuando la enzima esta reducida, el sitio activo se encuentra en una conformación denominada “fully folded” con Cp en el extremo de una α-hélice y a 14 Å de Cr. Sin embargo cuando la enzima esta oxidada formando el disulfuro Cp-Cr, el sitio activo está desestructurado y la α-hélice que lo contiene se convierte en un loop, a esta conformación se le denomina “locally unfolded”. La transición α-hélice→loop es necesaria para acercar la Cp-SOH a Cr y al momento no es claro si la enzima se encuentra en un equilibrio conformacional fully folded-locally unfolded o si es la formación del Cp-SOH la que dispara la transición. Para que Cr reaccione con Cp-SOH es necesario que se desprotone, ya que es el tiolato (S-) la forma reactiva y no el tiol (SH). En este sentido buscamos si algún residuo cercano a Cr podría actuar como base y abstraer el protón; encontramos un residuo de Glu143 que se encuentra bien posicionado para realizar esta función y alineando secuencias de varias prxs con igual mecanismo que PRDX 5 resultó que es un residuo conservado. Una vez que desprotona a Cr podría entregar el H+ a la Arg127 que finaliza desprotonada en la reacción de formación de Cp-SOH, o al grupo saliente OH-. En el presente proyecto se plante el estudio del equilibrio fully-folded-locally unfolded tanto en la enzima reducida (Cr-SH) como en la enzima oxidada a sulfénico (Cr-SOH) y la elucidación de la función del residuo Glu143 en la reacción de formación del disulfuro. Con los resultados obtenidos se pretende determinar si es la Cr-SOH la que dispara la transición FF→LU o si la enzima existe en ambas conformaciones, además hallar la barrera energética de la transición, determinando su influencia en la catálisis enzimática. Por otro lado, confirmar o refutar la hipótesis acerca de la función de E143, determinando la constante de velocidad de la formación del disulfuro en enzimas mutantes carentes de E143 (E143A y E143Q) y estudiando teóricamente el mecanismo detallado a nivel atómico y electrónico en la enzima wild type.