Peroxirredoxina 3 en la reducción de peroxinitrito mitocondrial: cinética, consecuencias estructurales y funcionales

Las peroxirredoxinas son peroxidasas dependientes de tioles claves en la señalización redox y en la detoxificación de peróxidos. Las mitocondrias son sitios principales de formación de peroxinitrito, compuesto oxidante y nitrante, cuya formación ha sido vinculada a procesos fisiopatológicos, incluyendo diabetes, enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares. En este proyecto planteamos investigar la actividad peroxinitrito reductasa de la peroxirredoxina 3 (Prx3), peroxirredoxina exclusivamente mitocondrial, que posee un rol clave en la reducción de otros peróxidos. Buscaremos determinar el mecanismo catalítico y cinética de reducción de peroxinitrito. Determinaremos el mecanismo y cinética de reducción de la forma oxidada de Prx3 por diferentes sistemas reductores mitocondriales, tales como los sistemas tiorredoxina 2/tiorredoxina reductasa /NADPH, glutarredoxina 2/tiorredoxina reductasa/NADPH y glutarredoxina 2/GSH/glutatión reductasa/NADPH. Utilizaremos los datos generados para realizar simulaciones computacionales que nos permitan predecir la importancia de Prx3 como blanco de peroxinitrito en presencia de otros blancos mitocondriales y la capacidad del oxidante de difundir fuera de mitocondria, en diferentes condiciones metabólicas. Determinaremos la susceptibilidad de la Prx3 a diferentes modificaciones nitro-oxidativas mediadas por peroxinitrito, incluyendo a) inactivación por sobreoxidación de la cisteína peroxidática; b) nitración de residuo(s) de tirosina; c) S-nitrosación; d) S-glutationilación. Realizaremos determinaciones cinéticas, identificaremos el(los) sitio(s) de modificación, determinaremos el efecto de estas modificaciones en la actividad peroxidasa, actividad chaperona y susceptibidad a inactivación oxidativa, e investigaremos su reversibilidad por diferentes sistemas reductores mitocondriales. Realizaremos simulaciones computacionales de dinámica molecular, conjuntamente con estudios biofísicos de proteínas, buscando determinar las bases moleculares de los cambios funcionales observados. Se generarán y caracterizarán formas mutantes de Prx3 en residuos que estos estudios señalen como relevantes en los cambios funcionales. Finalmente, purificaremos mitocondrias de corazón y cerebro de rata, las estimularemos para la producción endógena de peroxinitrito, y buscaremos la presencia de las modificaciones nitro-oxidativas en estudio en Prx3. Evaluaremos la reversibilidad de dichas modificaciones y el efecto de diferentes inhibidores y antioxidantes sobre su producción.