Estudio de la modulación de la liberación de calcio en el músculo esquelético de ratón. Rol de la fosforilación y de los canales de cloro intracelulares.

En el músculo esquelético la liberación de Ca2+ tiene lugar a nivel de la tríada donde se encuentra el canal de liberación de Ca2+, el receptor de rianodina (RyR). Este canal forma un complejo macromolecular en asociación con el sensor de voltaje del acoplamiento excitación-contracción (AEC) que incluye varias proteínas transmembrana como la triadina, la junctina y JP45. Además asociadas a la gran porción citoplasmática del RyR se encuentran proteínas con actividad enzimática como la calmodulina quinasa, la proteína quinasa A o fosfatasas como la proteína fosfatasa I. También se unen al RyR calmodulina y la proteína ligadora de Ca2+ S100A. Recientemente se ha descrito el efecto modulador sobre el RyR de una proteína que forma canales de Cl- intracelulares, CLIC-2. Estas proteínas pueden tener efectos sobre la liberación de Ca2+, ya sea directamente interactuando con el RyR como fue descrito para CLIC-2 o influenciando la liberación al constituir canales que proveen una vía para un flujo contraiónico que compensa la masiva salida de Ca2+ del RS. Se propone estudiar la modulación del flujo de liberación por estos mecanismos en fibras musculares aisladas de ratón registrando el Ca2+ citoplasmático mediante sondas fluorescentes y el Ca2+ en el interior de retículo sarcoplasmático mediante la expresión de un biosensor. De las medidas de Ca2+ se derivará el flujo de liberación del catión y se estimará la permeabilidad de la membrana del RS al mismo. Estos experimentos se realizarán con la técnica del parche y se medirán las señales ópticas por técnicas de fluorescencia convencionales y mediante microscopía confocal. Se estudiarán los efectos de activadores e inhibidores de las enzimas mencionadas sobre el flujo de liberación de Ca2+ y sus componentes en condiciones controladas de potencial de membrana y de Ca2+ libre intracelular. A través de técnicas inmunohistoquímicas se intentará identificar los canales de Cl- intracelulares presentes en el músculo esquelético. Para evidenciar su rol en la modulación del AEC, realizaremos experimentos convencionales como sustitución iónica, uso de bloqueantes específicos y otras modificaciones del medio que nos permitan sacar conclusiones sobre el mismo. Utilizaremos además una aproximación alternativa para este objetivo: mediante interferencia de ARN intentaremos suprimir o reducir la expresión de los canales de Cl- intracelulares que hayamos identificado para luego analizar las consecuencias de esta supresión sobre el AEC. Los resultados obtenidos de este proyecto contribuirán a aclarar el rol de los diferentes mecanismos de regulación del AEC en condiciones normales y valorar como pueden incidir en condiciones de hiperactividad muscular que lleven a la fatiga. Este proyecto contribuirá además fuertemente a consolidar el uso de técnicas de biología molecular asociadas a estudios electrofisiológicos e imagenológicos en nuestro laboratorio con la consiguiente formación de recursos humanos en la especialidad.