Efectos de proteínas de tipo Kunitz de Echinococcus granulosus, inhibidoras de ASICs, sobre la funcionalidad de células dendríticas activadas por acidosis extracelular.

Los procesos inflamatorios suelen generar acidez local. Existe un papel modulador del ácido sobre la respuesta inmune, que no se comprende enteramente. A pesar de esto, existen resultados bastante claros para células dendríticas (DCs), que indican un rol activador de la acidosis, en términos de fenotipo celular y de función propiamente dicha, si bien la caracterización de este fenómeno es aún incompleta. La activación parece estar parcialmente mediada por ASICs, canales de sodio activados por ácido. En etapas tempranas de la infección por Echinococcus granulosus larvario se genera inflamación local. Una vez establecido el metacestodo, a veces la inflamación persiste, siendo típicamente granulomatosa. El parásito queda rodeado de macrófagos especializados de la reacción granulomatosa, que muy probablemente secretan ácido como mecanismo efector vía V-ATPasa. Pese a esto, el parásito logra persistir, posiblemente mediante mecanismos determinados por moléculas expuestas al hospedero. E. granulosus expresa una familia (EgKU) de proteínas tipo Kunitz, potencialmente secretadas. Las proteínas Kunitz son ancestralmente inhibidores de proteasas, pero algunas han desarrollado evolutivamente actividad bloqueante de canales iónicos. Dos miembros de la familia, EgKU1 y EgKU4, bloquean canales de potasio activados por voltaje (Kv) y ASICs; un tercer miembro EgKU3, tiene actividad marginal sobre ASICs. En experimentos previos observamos una total inhibición del aumento en la expresión de MHCII, CD86 y CD11c inducido por acidosis extracelular en BMDC, por 10 pM de EgKU4. Entonces, los Kunitz bloqueantes de ASICs son moléculas candidatas a inhibir la detección de acidosis por DCs. En este proyecto proponemos evaluar la capacidad de proteínas Kunitz de E. granulosus bloqueantes de ASICs de inhibir los efectos de la acidosis extracelular sobre la funcionalidad de DCs, y profundizar en características no estudiadas de dichos efectos, empleando sistemas experimentales in vitro e in vivo. Se estudiarán los efectos de EgKU-1/EgKU-4/EgKU-3 sobre el aumento en la capacidad endocítica de BMDC inducido por acidosis extracelular, ya reportado, mediante incorporación de DQ-OVA a BMDC, por citometría de flujo. Luego se evaluará la capacidad de DCs condicionadas con medio ácido de estimular y polarizar células T CD4+ específicas de antígeno, in vitro e in vivo, y la capacidad de las EgKU bloqueantes de ASICs, de inhibir estos efectos. En particular, se harán co-cultivos de BMDC incubadas con Kunitz, expuestas a pH ácido y cargadas con OVA o pOVA (péptipo de OVA), con células T de ratones transgénicos OTII (con TCR específico para pOVA). Se analizará proliferación, y producción de IL-2 y de citoquinas características de los perfiles Th1, Th2, Th17 y reguladora. Se inyectarán BMDC incubadas con Kunitz, expuestas a pH ácido y cargadas con OVA, por vía intravenosa en ratones, re-estimulándose luego ex vivo los esplenocitos y midiéndose citoquinas indicadoras de diferentes perfiles de respuesta. Esperamos aportar información sobre la función de los Kunitz en el contexto del granuloma en la infección por E. granulosus. Nos interesa encontrar un inhibidor selectivo de ASICs por su potencial en tratamientos de disfunciones neurológicas y/o inflamatorias. Se completará información faltante sobre los efectos de la acidosis sobre la funcionalidad de DCs.