Capacidad fertilizante del semen sexado Bovino congelado-descongelado vs no sexado con ovocitos viables en fertilización in vitro (FIV)

Predeterminar el sexo de las crias principalmente en Bovinos de leche significaría un gran avance en la rentabilidad del sector, esto se hiso posible con la creación del citometro de flujo que selecciona los espermatozoides ( spz) X e Y, por la diferencia de ADN (4% en bovinos) con una confiabilidad del 90%.Se puede producir 6 a 8 dosis de aproximadamente 2 X 106 de spz/hora de semen sexado(Sx). Con la Fecundación in vitro (FIV) se incrementa la eficiencia ya que es posible fertilizar gran número de ovocitos La selección de los ovocitos es primordial para obtener complejos cumulus ovocitos (COC) que sean capases de ser efectivamente fertilizados, con la utilización de las tinciones Azul Tripan (AT) y azul Cresyl Brillante (ACB) es posible determinar la viabilidad de los ovocitos y la competencia para ser fecundados. El objetivo de esta investigación es estudiar la capacidad fertilizante del semen bovino Sx y no sexado (Ns) en COCs cuya viabilidad y competencia fue determinada con las tinciones At y ACB, en las dos estaciones extremas del año invierno y verano. En cada réplica se realizara en el SX y en el NS el cálculo de la concentración de las pajuelas, el estudio de la motilidad individual (Subjetivo) y del vigor. Los COC se obtendrán de ovarios de hembras bovinas faenadas. Se transportaran en 5 horas en solución salina isotónica a 37ºC. Los folículos de 2 a 8 mm de Ø seran aspirados con jeringa y aguja hipodérmica 18G, utilizando medio buffer fosfato salino modificado (m-PBS), + 5% de suero fetal bovino (SFB) y gentamicina (G). Los COCs clases A y B serán lavados 3 veces en medio (m-PBS), + 5% de Suero fetal bovino y 50mg/ml G en cajas de Petri de 35 mm de Ø. Se adiciona AT a 4.5 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente, se descartan los COC teñidos de azul. Los no teñidos se lavan 2 veces en m-PBS, se colocan en TCM-199 + 5% SFB+ G con ACB 22mM, en incubadora a 38.5 ºC y 5% CO2 y 90% de humedad, por 90 min, luego se observan los COCs bajo lupa, se descartan los que tienen citoplasmas sin teñir. Se lavan 2 veces en TCM, se incluyen en gotas de 100µl de TCM ,15 COCs/gota + 5% SFB + 0.005 U/ml de FSH-p + 10IU hCG/ml +1 μg Estradiol (E2) /ml + G cubiertas con aceite mineral. Se colocan en incubadora 22 horas. Luego se formaran al azar 2 grupos: Grupo 1 (G1) NS, Grupo 2 (G2) SX. La capacitación del SX y del NS con BO se realizara por centrifugación (500 G durante 5 minutos), en BO de lavado, se aspirara el sobrenadante y el pellet se diluye con BO de dilución ajustando la concentración a 4x106 spz/ml. Luego de la fecundación, los ovocitos se denudaran mediante vortex en TCM-199, + 5% de SFB y G por 5 minutos. Los presuntos cigotos de los grupos se cultivaran para desarrollo en CR1aa + 5% de SFB y G, en incubadora. A las 48 h se estudiara la tasa de división, a los 7 días se evaluara el desarrollo a Blastositos. La investigación se realizara en 2 estaciones (invierno- verano).