Búsqueda de interactores intracelulares de la cápside del virus de la leucosis bovina

Búsqueda de interactores intracelulares de la cápside del virus de la leucosis bovina La Leucosis Bovina Enzoótica es una enfermedad infecciosa del ganado bovino, causada por un deltaretrovirus denominado Virus de la Leucemia Bovina (VLB), que infecta principalmente a los linfocitos B y puede causar una patología linfoproliferativa. La prevalencia de la infección por VLB presenta una distribución mundial excepto en algunas áreas de Europa occidental, donde se ha logrado conseguir un status libre de enfermedad. Este proyecto resulta de interés ya que en Uruguay se ha determinado una prevalencia de hasta un 77% que conlleva grandes pérdidas en el sector agropecuario. El genoma del VLB exhibe dos copias idénticas de ARN simple, presentando tres genes estructurales: gag (group-associated antigen), pol (polymerase) y env (envelope). La poliproteína Gag se escinde por acción de la proteasa viral en sus tres dominios: Matriz (15KDa), Cápside (CA, 24KDa) y Nucleocápside (12KDa). La proteína cápside se autoensambla mediante la interacción de hexámeros y pentámeros formando una estructura supramolecular con varios cientos de copias de CA. Al interaccionar el virión maduro con los receptores específicos de la superficie de la célula hospedera se permite la fusión de sus membranas y la entrada de la cápside al citoplasma donde inicia un proceso conocido como desensamblado (“uncoating”). Existe poca evidencia sobre las interacciones que se establecen entre la cápside del VLB y las proteínas del linfocito bovino una vez que el virus ha infectado la célula, aunque sí se han dilucidado múltiples interactores de la cápside de otros retrovirus, (HIV-1). Dentro de ellos se destacan interacciones con proteínas del citoesqueleto como proteínas asociadas a microtúbulos, MAP1. También están descritos factores antivirales como TRIM5α que interacciona con la cápside de HIV, determinando un bloqueo en la replicación viral. Por otra parte la cápside es el factor determinante en el importe nuclear del HIV-1 al interaccionar con nucleoporinas (como Nup153). Desde hace años nuestro grupo de investigación trabaja con la proteína cápside y se han logrado determinar dos características fundamentales: la estructura cristalográfica de la proteína y las condiciones que propician su autoensamblado. Nos planteamos como objetivo de este proyecto identificar proteínas intracelulares del linfocito B bovino que interaccionen con la cápside del VLB. Para ello diseñamos una estrategia experimental en la cual vamos a expresar la proteína cápside recombinante en E. coli BL21(DE3)pLysS y purificarla mediante cromatografía de afinidad a metales y posterior gel filtración. Por otra parte obtendremos diferentes fracciones subcelulares de linfocitos bovinos a partir de bazos bovinos mediante lisis con diferentes detergentes y centrifugación diferencial. Luego se realizará el aislamiento de posibles interactores de la proteína CA mediante distintas estrategias de pull-down: Utilizando directamente la proteína autoensamblada formando multímeros que sedimentan en solución, e inmovilizando covalentemente la proteína CA a diferentes matrices comerciales. La identificación de los posibles interactores se hará mediante un análisis proteómico. Una vez identificados estos interactores elegiremos algunos de interés biológico para caracterizar su interacción cinética y termodinámicamente.